Alternatives aux "îlots humains natifs" pour la recherche in vitro et in vivo : les pseudo-îlots et les cellules endocrines pancréatiques provenant de cellules souches pluripotentes - le rôle de la progerine dans la différenciation et la maturation

Introduction: The use of human islets of Langerhans is the gold standard for research, both for physiological research and for the development of new therapeutic molecules for the treatment of type 2 diabetes. The demand of human islets for research projects is constantly growing however, the availability is limited and different islet preparations show significant variability between human pancreata.Objectives: The main objective of this thesis was to propose an alternative to native human islets that can provide homogeneous and abundant pancreatic islets for research. To do this, we had two main objectives: 1) the production of controlled diameter pseudo-islets from human pancreata, and the evaluation of their function in vitro and in vivo compared to their native islet counterparts; 2) the optimization of the production of pancreatic endocrine cells from different pluripotent stem cell lines and evaluation of the impact of progerin on the differentiation and maturation of the cells produced. Pluripotent stem cells from healthy donors (H1, WiCell) and from patients affected with accelerated aging disease Progeria (HGPS, iStem).Material and Methods: The pseudo-islets were formed in clinical islet medium (CMRL 1066 human albumin, insulin) 7 days using the 5D Sphericalplate (Kulgelmeiers) and compared to the native islets D1 (day 1) and D7 (day 7) from the same donor.The differentiation of pluripotent stem cells (iPS DF19.9, H1 and iPS HGPS cells) was optimized using different protocols: the Rezania protocol, the SD Kit (StemCell Technologies) and the Nostro protocol. For in vitro maturation gene expression among different cell lines was evaluated by qPCR. Protein expression was assessed by immunofluorescence technique and Flow cytometry analysis (EGID).For in vivo maturation, after transplantation under the kidney capsule of immunodeficient mice, blood glucose and human c-peptide measurements were assessed as well as metabolic test such as IPGTT were performed.Results: The pseudo-islets (n=4) generated in clinical islet medium secreted significantly less insulin in vitro than the native islets at D1 but with no significant difference from the native islets at D7. In both groups at D7, a significant decrease in intracellular insulin was observed compared10to native islets at D1. In vivo, the native islets at D1 secrete significantly more human c-peptide than the native islets at D7, while the difference is not significant between the native islets at D1 and the pseudo-islets at D7. In addition, morphometric analysis of the grafts revealed that the pseudo-islets tend to have more glucagon positive cells than the other two groups.Optimization of the differentiation of pluripotent stem cells allowed us to obtain more than 95% endoderm for H1 cells and 80% for iPS HGPS cells. For both lines, we generated 95% of pancreatic progenitor cells. The comparison of maturation genes revealed that progerin lead to a slight increase of cell maturation in the iPS HGPS group compared to H1 cells. However, no differences in in vivo function was observed. Age-related markers (53BP1, IGF1r, p16 and yH2AX) which validated in a pancreas from an elderly donor and an insulinoma. We identified yH2AX after 6 months transplantation of H1-grafts in endocrine and non-endocrine cells, while the expression in iPS HGPS-grafts appeared in the majority of cells, which had various shape of nucleiConclusion: This work provided positive results in terms of functional pseudo-islets and stem cells derived pancreatic endocrine cells. However, they remain preliminary and further studies must be conducted to provide realistic alternatives to native human islets for research.Introduction : L'utilisation des îlots humains de Langerhans est la référence pour la recherche, tant physiologique que pour le développement de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. La demande d'îlots de Langerhans humains pour des projets de recherche est en constante augmentation, cependant, la disponibilité est limitée et les différentes préparations d'îlots de Langerhans révèlent une grande variabilité entre elles.Objectifs : L'objectif principal de cette thèse était de proposer une alternative aux îlots de Langerhans humains natifs qui permettrait d’obtenir des îlots pancréatiques homogènes et en quantité abondante pour les projets de recherche.Pour ce faire, nous avions deux objectifs principaux : 1) la production de pseudo-îlots de diamètre contrôlé à partir de pancréas humain, et l'évaluation de leur fonction in vitro et in vivo par rapport à leurs équivalents îlots natifs ; 2) l'optimisation de la production de cellules endocrines pancréatiques à partir de différentes lignées de cellules souches pluripotentes et l'évaluation des effets de la progérine sur la différenciation et la maturation des cellules produites. Les cellules souches pluripotentes utilisées provenaient de donneurs sains (H1, WiCell) et de patients atteints de Progeria (HGPS, iStem).Matériel et méthodes : Les pseudo-îlots ont été formés dans un milieu d'îlots clinique (CMRL 1066 albumine humaine, insuline) pendant 7 jours en utilisant les Sphericalplate 5D (Kulgelmeiers) et comparés aux îlots natifs J1 (jour 1) et J7 (jour 7) du même donneur.La différenciation des cellules souches pluripotentes (cellules iPS DF19.9, H1 et iPS HGPS) a été optimisée par différents protocoles : le protocole Rezania, le SD Kit (StemCell Technologies) et le protocole Nostro. L'expression des gènes de maturation in vitro entre différentes lignées cellulaires a été évaluée par qPCR. L'expression des protéines a été évaluée par immunofluorescence et par cytométrie en flux (plateforme EGID).Pour la maturation in vivo, après la transplantation sous la capsule rénale de souris immunodéficientes, des mesures de glycémie et de c-peptide humain ont été effectuées, ainsi que des tests métaboliques comme l'ipGTT.12Résultats : Les pseudo-îlots (n=4) générés ont sécrété significativement moins d'insuline in vitro que les îlots natifs à J1 mais sans différence significative avec les îlots natifs à J7. Dans les deux groupes à J7, on a observé une diminution significative de l'insuline intracellulaire comparativement aux îlots natifs à J1. In vivo, les îlots natifs à J1 sécrètent significativement plus de c-peptide humain que les îlots natifs à J7, alors que la différence n'est pas significative entre les îlots natifs à J1 et les pseudo-îlots à J7. De plus, l'analyse morphométrique des greffons a révélé que les pseudo-îlots ont tendance à avoir plus de cellules glucagon-positives que les deux autres groupes.L'optimisation de la différenciation des cellules souches pluripotentes a permis d'obtenir plus de 95% d'endoderme pour les cellules H1 et 80% pour les cellules iPS HGPS. Pour les deux lignées, nous avons généré 95 % de progéniteurs pancréatiques. La comparaison des gènes de maturation a révélé que la progérine conduisait à une légère augmentation de la maturation cellulaire dans le groupe iPS HGPS par rapport aux cellules H1. Des marqueurs liés à l'âge (53BP1, IGF1r et yH2AX) ont été validés dans un pancréas provenant d'un donneur âgé et un insulinome. Cependant, aucune différence de la fonctionnalité in vivo n’a été observée. Six mois post transplantation, nous avons identifié yH2AX dans des cellules endocrines et non endocrine des greffons H1 alors que dans les greffons HGPS, nous l’avons observé dans une plus vaste proportion de cellules présentant différentes formes de noyaux [...